Detección de autofagia

La autofagia es un proceso de degradación intracelular que está involucrado en muchas condiciones fisiológicas y patológicas. Cuando esta se induce, se forma una membrana de aislamiento que envuelve parte del citoplasma y forma una vesícula de doble membrana (autofagosoma). La membrana exterior del autofagosoma se fusiona con un lisosoma para formar el autolisosoma, degradando los componentes del orgánulo engullido junto a la membrana interior del autofagosoma. El término "flujo autofágico" hace referencia a todo el proceso dinámico de la autofagia.

En mamíferos LC3B es un marcador de autofagosomas que es procesado por Atg4 en su extremo -C para convertirse en LC3-I. LC3-I es mayoritariamente citosólica, pero se lipidiza mediante la conjugación de fosfatidiletanolamina (PE) para formar LC3-II, la cual se localiza en las membranas externa e interna del autofagosoma. Tras la fusión del autofagosoma con el lisosoma, LC3-II unida a la membrana interna es degradada por las proteasas lisosomales. La monitorización de la conversión de LC3-I a LC3-II mediante el cambio en el peso molecular es un método habitual para controlar los cambios en la vía autofágica. Visualizar LC3B en la célula desde la forma difusa (en forma de LC3-I citostólica) hasta la forma concentrada (LC3-II en autofagosomas o puncta) es un método adicional para monitorizar los cambios en la autofagia.

Existen diversos métodos para monitorizar la formación de autofagosomas y el flujo autofágico. Sin embargo, cada método tiene sus limitaciones, por lo que se suele utilizar más de uno para validar la actividad autofágica. Un método habitual para medir la actividad de la autofagia consiste en utilizar el número de autofagosomas determinado por la localización de GFP-LC3. Sin embargo, los resultados pueden ser engañosos ya que tanto la inducción como la inhibición de la autofagia pueden conducir a un aumento del acúmulo de autofagosomas, dependiendo de en qué punto de la vía se produzca la alteración.

El Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay System puede utilizarse en tres módulos de detección para cuantificar de forma inequívoca el flujo autofágico. En primer lugar, el ensayo reportero mide el flujo autofágico monitorizando los niveles totales de LC3 basándose en una lectura de placa. Las células que expresan de forma estable el reportero y que son tratadas con inductores de la autofagia muestran una disminución de la señal luminiscente. Mientras que el tratamiento con inhibidores dará lugar a un aumento del nivel de reportero LC3, lo que resultará en un aumento de la señal luminiscente. En segundo lugar, el marcador HiBiT del reportero LC3 puede utilizarse con el Nano-Glo® HiBiT Blotting System para monitorizar el cambio de peso molecular de LC3-I a LC3-II. Este sistema sustituye los engorrosos western blots por un protocolo más rápido y sencillo. Por último, la fracción HaloTag® del reportero puede utilizarse con dyes fluorogénicos para visualizar la localización de LC3 dentro de las células. Llevar acabo ensayos cuantitativos basados en lecturas de placas, además de ensayos complementarios de imagen y blotting con el uso de un solo reportero, le permitirá un análisis versátil de la vía autofágica.