GloSensor™ Technology

Luciferase Biosensor for Real-Time Detection of Signaling Events

La tecnología GloSensor™ proporciona una plataforma de biosensores flexibles basados en luciferasa para la detección en tiempo real de eventos de señalización en células vivas con sensibilidad, linealidad y especificidad.

La luciferasa GloSensor™ se permuta circularmente, uniendo las terminaciones N y C de tipo salvaje con un polipéptido o dominio proteico y creando terminaciones de ingeniería en otras partes de la estructura. La unión del analito o la escisión de la proteasa provocan un cambio conformacional en el biosensor que promueve un gran aumento de la actividad luminiscente. La magnitud del aumento de luminiscencia es directamente proporcional a la cantidad de analito o actividad de proteasa presente.

Simple, Scalable, Live-Cell Protocol

GloMax Discover System Multimode Plate Reader

El protocolo de ensayo no lítico de células vivas es fácil de realizar y permite monitorizar la actividad del biosensor de forma continua o en un único momento. El perfil cinético de los eventos de señalización celular puede seguirse en tiempo real y los ensayos se escalan fácilmente a formatos de microplacas de alta densidad, incluidas placas de 96, 384 y 1536 pocillos.

Los pasos del protocolo son

Pre-equilibrar las células con el reactivo GloSensor™ cAMP durante ~2 horas.
Tratar con agonistas/antagonistas específicos o compuestos de la biblioteca.
Medir la luminiscencia después de 10-30 minutos de forma continua o en un único punto temporal.

Cualquier luminómetro con inyectores es suficiente para leer el ensayo.

Perform cAMP, cGMP or Protease Assays

Monitor Intracellular cAMP in a Live-Cell Assay

El ensayo GloSensor™ cAMP puede utilizarse para monitorizar la activación de receptores 7-TM, acoplados a proteínas G (GPCR), endógenos o sobreexpresados, junto con fosfodiesterasas (PDE) responsables de degradar el AMPc intracelular. Los cambios intracelulares en la concentración de AMPc pueden seguirse utilizando un formato de ensayo de células vivas, no lítico, que permite la monitorización en tiempo real de los cambios en la concentración de AMPc.

Existen diferentes biosensores disponibles para su uso en el ensayo GloSensor™ cAMP. En cada caso, se fusiona un dominio de unión a AMPc con una forma permutada circularmente de luciferasa de luciérnaga. La secuencia de cada uno difiere, dando biosensores con una gama de afinidades para el AMPc. En general, el plásmido pGloSensor™-22F cAMP es el más adecuado para la mayoría de las aplicaciones, ya que proporciona una combinación única de sensibilidad y rango dinámico. El constructo 22F es lo suficientemente sensible como para monitorizar la actividad agonista inversa o la activación del receptor acoplado a Gi en ausencia de forskolina añadida, pero posee un rango dinámico lo suficientemente grande como para monitorizar aumentos muy grandes en la concentración intracelular de AMPc.

Solicitar más vectores y líneas celulares de AMPc

12766MA_600px — **Respuesta cinética del GloSensor™ cAMP comparada con un inmunoensayo cAMP.** Las células HEK293 que expresan transitoriamente el plásmido pGloSensor™-22F cAMP se trataron secuencialmente con 1µM de isoproterenol (ISO), 10µM de propranolol (PRO) y 10µM de forskolina (FSK). Se utilizó el protocolo de ensayo de AMPc GloSensor™ de células vivas, no lítico, para monitorizar los niveles de AMPc, mientras que se lisaron pocillos replicados en cada punto temporal para el inmunoensayo de AMPc (Enzo Life Sciences). Las muestras por encima de aproximadamente 20 nM requirieron dilución para que el inmunoensayo de AMPc estuviera dentro del intervalo lineal de la curva estándar. (ISO = agonista de ADRB2, PRO = antagonista de ADRB2, FSK = activador permeable celular de la adenilil ciclasa).

Monitor Intracellular cGMP in a Live-Cell Assay

El ensayo GloSensor™ cGMP se utiliza para monitorizar cambios en la concentración intracelular del segundo mensajero cGMP. El ensayo puede utilizarse para monitorizar la activación de guanilil ciclasas endógenas o sobreexpresadas, incluyendo la guanil ciclasa soluble (sGC) o las isoformas del receptor del péptido natriurético auricular (NPRA y NPRB), junto con las fosfodiesterasas (PDE) que son responsables de degradar el GMPc intracelular. Los cambios intracelulares en la concentración de GMPc pueden seguirse utilizando un formato de ensayo no lítico de células vivas, que permite la monitorización en tiempo real de los cambios en la concentración de GMPc.

Existen diferentes biosensores disponibles para su uso en el ensayo GloSensor™ cGMP. En cada caso, se fusiona un dominio de unión al GMPc con una forma permutada circularmente de luciferasa de luciérnaga. El dominio de unión al cGMP y la secuencia de cada uno difieren, dando biosensores con diferentes afinidades por el cGMP. En general, se prefiere el constructo 40F cuando se sobreexpresa una guanilil ciclasa, ya que proporciona un rango dinámico máximo a altos niveles intracelulares de GMPc. Por el contrario, se prefiere el constructo 42F cuando se ensaya una guanilil ciclasa endógena, proporcionando la máxima sensibilidad para niveles intracelulares más bajos de GMPc.

Pedir ensayo cGMP

12767MA_600px — **Monitorización del GMPc en tiempo real.** Las células HEK293 que expresan transitoriamente el constructo 42F se trataron con dosis variables de nitroprusiato sódico (SNP), un donante de óxido nítrico, para activar la guanilil ciclasa soluble endógena (sGC). Se utilizó el protocolo GloSensor™ cAMP Assay de células vivas, no lítico, para monitorizar la respuesta de GMPc en tiempo real.

Luminescent Detection of Protease Activity

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Encargar ensayo de proteasa

GloSensor™ Plasmids

Ofrecemos dos variantes del biosensor, y recomendamos el plásmido pGloSensor™-22F cAMP como primera opción para la mayoría de las aplicaciones.

Plásmido pGloSensor™-22F cAMP. Tras la expresión in vitro libre de células, la versión codificada por este constructo muestra una mayor _EC50 para la activación junto con una mayor relación señal/fondo en la saturación de AMPc en relación con la versión codificada por el constructo pGloSensor™-20F cAMP. En general, hemos observado relaciones similares entre las dos construcciones cuando se compara su rendimiento en células vivas.

Plásmido pGloSensor™-20F cAMP. La versión codificada por este constructo funciona bien en células HEK293 a 37°C. La luminiscencia de la construcción pGloSensor™-22F cAMP Plasmid puede ser más difícil de detectar a temperaturas fisiológicas.

Para una explicación detallada de las diferencias de rendimiento entre los dos plásmidos, consulte la Sección 3.B, Recomendaciones sobre la elección del plásmido GloSensor™, en el Manual Técnico #TM076 (proporcionado en la Sección de Protocolo a continuación).

pGloSensor-22F cAMP Plasmid. — pGloSensor™-20F cAMP, número de acceso EU770615; secuencia (archivo .txt)
pGloSensor™-22F cAMP, número de acceso GU174434; secuencia (archivo .txt)

Protocolos

Complete Protocol

GloSensor™ cAMP Assay Technical ManualPDF (1631 KB) – English

Protocolos Rápidos

GloSensor cAMP Assay Quick Protocol FB113PDF (286 KB) – English

Contenido

Item	Part #	Presentación
GloSensor™ cAMP Reagent	E129A	1 × 25mg

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Certificado de Análisis

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Use Restrictions

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Condiciones de Almacenaje

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Contenido

Item	Part #	Presentación
GloSensor™ cAMP Reagent	E129B	1 × 250mg

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Contenido

Item	Part #	Presentación
pGloSensor™-22F cAMP Plasmid	E230A	1 × 20μg

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BY USE OF THIS PRODUCT, RESEARCHER AGREES TO BE BOUND BY THE TERMS OF THIS LIMITED USE LABEL LICENSE. If researcher is not willing to accept the terms of this label license, and the product is unused, Promega will accept return of the unused product and provide researcher with a full refund.
Researchers may use this product in their own research solely for the luminescent determination of molecular binding, enzymatic activity or other functional activity. Researchers shall have no right to modify or otherwise create variations of the nucleotide sequence encoding the GloSensor™ technology of this product (i.e., the bioluminescent chimeric protein comprising luciferase and other functional domains). Researchers may transfer derivatives to others provided that recipients agree to be bound by the terms of this label license prior to such transfer. No other use or transfer of this product is authorized without the prior express written consent of Promega. In addition, researchers must either: (1) use GloSensor™ cAMP Reagent for in vitro and in cell applications, and VivoGlo™ Luciferin, In Vivo Grade, for animal applications for all determinations of luminescence activity of this product and derivatives; or (2) contact Promega to obtain a license for use of the product and derivatives in conjunction with luminescent assay reagents not purchased from Promega. PROMEGA MAKES NO REPRESENTATIONS OR WARRANTIES OF ANY KIND, EITHER EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING FOR MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE WITH REGARDS TO THE PRODUCT. The terms of this label license shall be governed under the laws of the State of Wisconsin, USA.

Patent Pending.

U.S. Pat. No. 8,008,006.

U.S. Pat. No. 7,728,118 and other patents pending.

Contenido

Item	Part #	Presentación
pGloSensor™-20F cAMP Plasmid	E117A	1 × 20μg

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Patent Pending.

U.S. Pat. No. 8,008,006.

U.S. Pat. No. 7,728,118 and other patents pending.

Recursos

Artículos

In vitro structure–activity relationships and forensic case series of emerging 2‑benzylbenzimidazole ‘nitazene’ opioids

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GloSensor™ Technology

Biosensores de células vivas para la actividad de AMPc, GMPc o proteasas

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