Ensayos de detección de nucleótidos y cofactores
La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) es un importante cofactor para la producción de ATP durante la fosforilación oxidativa. La nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) es fundamental para las vías biosintéticas de creación de macromoléculas. Tanto el NAD como el NADP proporcionan poder reductor mediante la conversión entre las formas oxidadas (NAD+, NADP+) y las formas reducidas (NADH, NADPH).
El NAD tiene otro papel como sustrato en las reacciones de ribosilación del ADP implicadas en la reparación del ADN, la expresión génica, la regulación de las MAPK y la señalización del Ca2+.
Ofrecemos ensayos sensibles basados en bioluminiscencia para monitorizar los niveles celulares de NAD o NADPH oxidado, reducido o total mediante una reacción enzimática acoplada. La reacción central puede utilizarse para monitorizar el consumo o la producción de NADH o NADPH en ensayos in vitro y ensayos bioquímicos.
Cuando se estudia el metabolismo, el ATP es el centro de atención. Promega ofrece los ensayos bioluminiscentes de adición-mezcla-medida más sensibles para medir ATP en ensayos basados en células.
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Introducción a los ensayos de detección de nucleótidos y cofactores
Los dinucleótidos de nicotinamida adenina son cofactores solubles abundantes que sufren oxidación y reducción reversibles en las principales vías metabólicas. Son importantes en la investigación del cáncer porque, como metabolitos, pueden vincular las vías metabólicas al control transcripcional, la epigenética y la señalización celular cuando las células pasan de un metabolismo normal a un metabolismo de célula cancerosa (proliferativo). En las células están presentes en estados oxidados y reducidos en sus formas no fosforiladas (NAD y NADH) y fosforiladas (NADP y NADPH). Estos dinucleótidos funcionan por pares y cada par tiene funciones distintas.
El NAD y el NADH son cofactores clave en el metabolismo energético. En las células en reposo, la relación NAD+/NADH está más inclinada hacia el NAD+. Las células en proliferación tienden a tener un exceso de NADH. El NADH se genera durante la fosforilación a nivel de sustrato en la vía glucolítica y proporciona equivalentes con poder reductor para la producción de ATP durante la fosforilación oxidativa.
El NAD es conocido sobre todo por su papel en el metabolismo energético, pero también es utilizado por enzimas como la polimerasa poli ADP-ribosa (PARP) y las sirtuinas que llevan a cabo reacciones de ribosilación de ADP. Un área activa de investigación es la síntesis de-novo de NAD a partir de subproductos de las reacciones de ribosilación de ADP.
El NADP y el NADPH destacan por proporcionar poder reductor para las reacciones biosintéticas y la regeneración de dos moléculas de GSH a partir de GSSG. El NADP y el NADPH son difíciles de medir ya que este par es 10 veces menos abundante que el par NAD y NADH. El papel en la regeneración de GSH es crítico para controlar los niveles de ROS generados por la fosforilación oxidativa. Debido a las diversas funciones que desempeñan los dinucleótidos de nicotinamida adenina en la regulación celular, la expresión génica y las enfermedades, los biólogos están poniendo el foco en estas moléculas como indicadores del mecanismo de acción de los fármacos o de la toxicidad de los tratamientos, así como para la investigación en el descubrimiento de fármacos.
Los investigadores pueden monitorizar los niveles de estos nucleótidos y cofactores mediante ensayos bioluminiscentes sensibles que se adaptan a formatos para el cribado de alto rendimiento. Entre los formatos de ensayo alternativos se incluyen ensayos colorimétricos o fluorométricos menos sensibles basados en lectores de placas, que requieren un procesamiento adicional de las muestras. También pueden utilizarse técnicas de química analítica, como la espectrometría de masas, para controlar los niveles de cofactores.
