Cuantificación específica de ADN humano

Los métodos de purificación de ADN no pueden diferenciar entre el ADN humano y otro tipo de ADN (como por ejemplo, ADN bacteriano o fúngico). Por lo tanto, si la muestra no es pura y se desea determinar la concentración de ADN genómico humano presente, será necesario utilizar un sistema de cuantificación específico de ADN humano. En el ámbito forense, los sistemas más comunes se basan en la PCR en tiempo real y utilizan sondas de oligonucleótidos o cebadores marcados con fluorescencia para detectar y cuantificar un producto de la PCR en tiempo real. El progreso de la reacción puede monitorizarse como un cambio en la fluorescencia a lo largo del tiempo a medida que se acumulan productos específicos de la PCR. Durante la fase exponencial de la PCR el cambio de fluorescencia es proporcional a la acumulación del producto de la PCR. 

El PowerQuant™ System es un sistema de qPCR multiplex de cinco dyes y cuatro dianas, que utiliza la tecnología de sondas de hidrólisis. El sistema incluye tres dianas multicopia (autosómica, Y y degradación), un control positivo interno (IPC) y una referencia pasiva, cada uno de ellos en un canal diferente. La amplificación de la diana autosómica determina la concentración de ADN humano total, y la amplificación Y determina la concentración de ADN humano masculino en una muestra extraída. La diana de degradación evalúa el grado de degradación del ADN. La diana IPC es un control interno de la reacción de amplificación y evalúa la presencia o no de inhibidores de la PCR. El protocolo recomendado para el PowerQuant™ System utiliza una curva estándar de cuatro puntos creada a partir de la dilución en serie del PowerQuant™ Male gDNA Standard. La cuantificación de ADN utilizando el PowerQuant™ System proporciona resultados rápidos mediante un protocolo de ciclado térmico en la Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR System que dura aproximadamente 1 hora.

El Plexor® HY System es un ensayo de PCR en tiempo real que determina también la concentración de ADN humano total y ADN masculino de forma simultánea en una reacción. El kit contiene un control interno de PCR para comprobar los resultados falsos negativos que pueden producirse en presencia de inhibidores de PCR, además de una función de la curva de fusión para confirmar que se ha amplificado el producto correcto. El Plexor® HY System mide la reducción de la señal fluorescente durante la amplificación. La amplificación de cada diana utiliza dos cebadores, uno de los cuales contiene un reportero fluorescente y una base modificada. A medida que avanza la amplificación, la fluorescencia se reduce por la incorporación de un quencher fluorescente frente a la base modificada complementaria. El quencher se encuentra muy cerca del reportero fluorescente situado en el extremo del cebador, lo que provoca una reducción de la señal fluorescente. Una vez finalizada la PCR, se puede realizar un análisis de las curvas de fusión para disponer de un control interno que será útil en el diseño final del ensayo o para agilizar el troubleshooting.