Sistemas pull-down y de doble híbrido
Los ensayos pull-down y los sistemas de doble híbrido son métodos de uso habitual para el estudio de las interacciones entre proteínas. Ofrecemos sistemas pull-down basados en marcadores de afinidad a GST o HaloTag® y un sistema de doble híbrido diseñado para identificar interacciones de proteínas de mamíferos.
Los MagneGST™ Pull-Down Systems proporcionan partículas magnéticas ligadas a GSH que permiten la inmovilización sencilla de proteínas cebo de fusión a GST a partir de lisados bacterianos, junto con un sistema de transcripción/traducción in vitro para la expresión de proteínas presa. En el HaloTag® Mammalian Pull-Down System, la proteína de interés se une a una resina de afinidad mediante la proteína HaloTag®, la cual se une a la resina de forma rápida, covalente e irreversible. Estas propiedades aumentan la posibilidad de capturar complejos proteicos y retenerlos tras la captura.
En el CheckMate™ Mammalian Two-Hybrid System, una proteína se fusiona a un dominio de unión al ADN y una segunda proteína se fusiona a un dominio de activación transcripcional. La interacción entre las proteínas provoca la transcripción de un gen reportero, lo que da lugar a una detección por bioluminiscencia de las proteínas que interactúan.
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¿Qué son los sistemas pull-down y de doble híbrido?
Los ensayos pull-down y los sistemas de doble híbrido son herramientas utilizadas para identificar si dos o más proteínas interactúan. Estos ensayos de interacción entre proteínas pueden utilizarse para confirmar interacciones entre proteínas identificadas por otros métodos (como los ensayos de co-inmunoprecipitación) o para descubrir e identificar nuevas proteínas que interactúan entre si.
En los ensayos de pull-down, una proteína "cebo" se inmoviliza en una resina utilizando un marcador de afinidad como HaloTag o GST. Las proteínas "presa" que se unen a las proteínas cebo inmovilizadas se capturan a partir de lisados celulares o productos expresados in vitro. El protocolo del ensayo pull-down se divide en tres fases: 1) se expresa la proteína presa; 2) se inmoviliza la proteína cebo; y 3) se añade la proteína presa al sistema y se captura mediante la interacción cebo-presa.
Los sistemas de doble híbrido son métodos potentes para detectar interacciones proteína:proteína in vivo. La base de los sistemas de doble híbrido son los dominios modulares que se encuentran en algunos factores de transcripción: un dominio de unión al ADN, que se une a una secuencia específica de ADN, y un dominio de activación transcripcional, que interactúa con la maquinaria transcripcional basal. Un dominio de activación transcripcional en asociación con un dominio de unión al ADN promoverá el ensamblaje de los complejos ARN polimerasa II y aumentará la transcripción. En los sistemas de doble híbrido, la interacción entre las proteínas asociadas acerca los dominios de unión al ADN y de activación transcripcional, promoviendo la expresión de un gen reportero.
Los sistemas de doble híbrido y los ensayos pull-down in vitro pueden utilizarse para identificar interacciones proteína:proteína en todo el genoma o proteoma. Los ensayos pull-down in vitro pueden realizarse utilizando lisados celulares, lisados expresados in vitro, muestras de tejidos, etc. Estas opciones no son posibles con los métodos de doble híbrido.
