Cuantificación de ADN y ARN

Entre los métodos más utilizados para la cuantificación de ARN y ADN se encuentran la absorbancia, la fluorescencia y la qPCR. Cada uno tiene ventajas e inconvenientes, y la elección del método depende de la necesidad experimental y del ensayo posterior.

Los métodos de cuantificación por absorbancia son fáciles de aplicar y utilizan equipos y reactivos de laboratorio de uso común. Las lecturas de absorbancia se realizan a 260nm, donde el ADN absorbe la luz con mayor intensidad, y el valor generado permite estimar la concentración. Los métodos de absorbancia ofrecen las ventajas de la facilidad de uso y un amplio rango de detección, pero son menos sensibles que los métodos basados en fluorescencia o qPCR. Los métodos de absorbancia no pueden distinguir entre ADNss, ADNds o ARN, y pueden sobreestimar la concentración si hay contaminantes que absorben a 260nm.

Los métodos de cuantificación basados en la fluorescencia utilizan colorantes que se unen al ADNds, al ADNss o al ARN, dando lugar a un cambio conformacional que produce fluorescencia tras la excitación. La señal fluorescente es proporcional a la cantidad de ácidos nucleicos presentes. Los métodos de detección por fluorescencia son más sensibles que los de absorbancia, en particular para muestras con baja concentración de ADN, son rápidos y fáciles de usar y se incorporan fácilmente a los flujos de trabajo automatizados.

En la PCR en tiempo real (qPCR), la acumulación del producto de ADN se mide después de cada ciclo de amplificación de la PCR utilizando reporteros fluorescentes. La curva de amplificación generada muestra la señal fluorescente frente al número de ciclos y traza la acumulación de producto amplificado. El umbral de detección es el nivel de fluorescencia en el que la acumulación de producto puede distinguirse de la señal de fondo. El número de ciclo en el que el producto de amplificación cruza ese umbral de detección es el Ciclo de Cuantificación (Cq). Cuanto mayor sea la cantidad de ADN diana presente en la muestra, más temprano será el valor de Cq. Las ventajas de los métodos de cuantificación basados en la qPCR incluyen la sensibilidad y la capacidad de detectar múltiples dianas en una sola reacción mediante multiplexación. Dado que la qPCR es un método basado en la amplificación, también proporciona información sobre la amplificabilidad de la muestra, que es un indicador de la calidad del ADN.