Cuantificación para NGS
La secuenciación de nueva generación requiere una cuantificación de ácidos nucleicos precisa, consistente y sensible para garantizar unos resultados óptimos. Promega tiene soluciones para cada paso del proceso:
- QuantiFluor® Dyes para medir ADNdc, ADNmc y ARN utilizando un fluorómetro monotubo Quantus™ o Qubit™, o en un formato de microplaca de alto rendimiento en el GloMax® Discover, GloMax® Explorer o cualquier fluorómetro con filtros de excitación/emisión compatibles. QuantiFluor® es un método polivalente adecuado para la cuantificación previa y posterior a la preparación de librerías que ofrece el equilibrio de satisfacer los requisitos de sensibilidad y precisión con la facilidad de uso y el bajo coste.
- ProNex® DNA QC Assay permite tanto una cuantificación del ADN basada en qPCR estándar como una medida de control de calidad previa de las muestras para la preparación de la librería, todo en un único pocillo. Este ensayo está diseñado para muestras humanas y es el más adecuado para determinar la cantidad y calidad de FFPE o ADNccf tras la extracción inicial de ADN. ProNex® DNA QC Assay te ayudará a tomar decisiones sobre la idoneidad o no de muestras valiosas antes de realizar aplicaciones de secuenciación costosas y que requieren mucho tiempo.
- ProNex® Library Quant Kit te ayudará a cuantificar con precisión tus librerías preparadas antes de la secuenciación Illumina. Este método de qPCR está diseñado para las secuencias adaptadoras P5 y P7 de Illumina, proporcionando la mejor estimación de la concentración de la librería para determinar las diluciones de normalización y la agrupación de muestras antes de la secuenciación.
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Introducción a la cuantificación de ácidos nucleicos para NGS
La cuantificación del ADN puede tener un impacto significativo en el rendimiento de la secuenciación. Hay dos pasos clave en cualquier flujo de trabajo de NGS que requieren cuantificación: 1.) la preparación previa a la librería y 2.) la preparación posterior a la librería.
Cuantificación previa a la preparación de la librería:
Independientemente de si estás creando una librería basada en ligación o en amplicones PCR, añadir demasiado o demasiado poco ADN a una librería de NGS puede tener efectos perjudiciales. El uso de un método consistente, sensible y específico para determinar la concentración permitirá la entrada adecuada de la diana para una librería determinada.
Si se añade demasiado poco ADN, se corre el riesgo de obtener un rendimiento muy bajo de la librería y aumentar el sesgo de la PCR. Los kits de preparación de librerías de NGS están diseñados para tener una proporción óptima de cebadores, adaptadores y ADN. Una proporción demasiado alta puede dar lugar a dímeros de cebadores o a que los adaptadores se liguen entre sí. Aunque estos artefactos pueden eliminarse en su mayor parte durante la selección de tamaño, los que queden ocuparán un valioso espacio de secuenciación y producirán lecturas desperdiciadas.
Si se añade demasiado ADN a la ligación del adaptador, se pueden obtener concatámeros (fragmentos que se unen), lo que da lugar a secuencias falsas o a una librería desperdiciada que se eliminará durante la selección de tamaño final. En las librerías de amplicones obtenidos por PCR, el exceso de ADN puede provocar artefactos de PCR o fallos de amplificación. La preparación de librerías supone una importante inversión de tiempo y dinero, y el tiempo empleado en preparar nuevas librerías debido a una cuantificación incorrecta es tiempo y dinero que podría dedicarse a actividades más valiosas.
Cuantificación posterior a la librería:
Una vez preparadas las librerías de NGS, es habitual agrupar numerosas muestras para la secuenciación multiplexada. Para que la NGS sea rentable para paneles específicos, es fundamental medir la concentración de las librerías individuales y normalizar las muestras antes de agruparlas. Si se realiza correctamente, la profundidad de las lecturas relativas de cada una de las muestras será muy similar y la profundidad y uniformidad de la cobertura de secuenciación serán suficientes para alinear adecuadamente las lecturas y detectar mutaciones de baja frecuencia. Mediante una normalización consistente de las muestras se puede lograr un equilibrio entre el coste de la secuenciación y la cobertura necesaria. La elección de la cuantificación es fundamental para obtener este equilibrio.
