Secuenciación Sanger
El sistema de electroforesis capilar (CE) Spectrum Compact es un instrumento de sobremesa diseñado para la secuenciación Sanger y el análisis de fragmentos. Spectrum Compact es compatible con aplicaciones de secuenciación Sanger para la verificación de llamadas de bases NGS y es un método eficaz para confirmar ediciones genómicas exitosas en cultivos transformados, así como clones secundarios de cribado para eventos de edición exitosos utilizando técnicas CRISPR-cas9.
Spectrum Compact está diseñado para su uso con las químicas de secuenciación existentes que utilizan dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) marcados con fluorescencia y kits STR de 4, 5 y 6 colorantes de Promega, así como otros kits disponibles en el mercado.
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Introducción a la secuenciación Sanger
En la secuenciación por colorante-terminador, se anuda un cebador de ADN a la plantilla que se va a secuenciar, y se extiende utilizando una ADN polimerasa. El conjunto de dNTP contiene desoxinucleótidos A, C, G y T no marcados, así como dideoxinucleótidos marcados con colorantes en concentraciones más bajas. Cuando se incorpora un dideoxinucleótido durante la extensión de la cadena, la ausencia del grupo hidroxilo 3’ impide una mayor extensión del amplicón. El producto truncado se marca entonces con un fluoróforo específico del nucleótido en la posición de terminación. En una reacción completa, debe haber amplicones terminados en cada posición y marcados con el colorante correspondiente al nucleótido final. Tras la limpieza para eliminar los nucleótidos no incorporados, los colorantes y los cebadores, las muestras se analizan por electroforesis capilar para separar los amplicones de diferentes tamaños.
El software Basecaller se utiliza para convertir el electoferograma sin procesar en un electroferograma de referencia. El software Basecaller aplica una corrección de movilidad específica de la química de secuenciación para tener en cuenta los cambios en la electromovilidad de los amplicones debidos a los fluoróforos incorporados.
El sistema Spectrum Compact CE permite separar y analizar los fragmentos de ADN generados en las reacciones de secuenciación Sanger.
